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Jul 01, 2023

Implementación de una nueva sonda de captura y ligadura

Malaria Journal volumen 22, Número de artículo: 21 (2023) Citar este artículo 1337 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics El cribado y tratamiento masivo (MSAT) para la eliminación de la malaria carece de un diagnóstico ideal

Malaria Journal volumen 22, Número de artículo: 21 (2023) Citar este artículo

1337 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

El cribado y tratamiento masivos (MSAT) para la eliminación de la malaria carece de una herramienta de diagnóstico ideal que permita realizar pruebas sensibles y asequibles a la población objetivo sobre el terreno. Este estudio evaluó si la sonda de captura y ligadura-PCR (CLIP-PCR) podría usarse en un MSAT de campo en la ciudad de Laiza, Myanmar.

El día 0, se recogieron dos gotas de sangre seca de cada participante. El día 1, cuatro técnicos analizaron todas las muestras para detectar Plasmodium en un laboratorio de 20 m2 con mesa de trabajo, una cabina de bioseguridad, un refrigerador, una incubadora con agitación de mesa y una máquina qPCR, utilizando CLIP-PCR con combinación de muestras, en una clínica de salud de la ciudad fronteriza china de Nabang. El día 2, todos los positivos fueron seguidos y tratados.

De 15.038 personas (65% de la población total) examinadas, 204 (1,36%) fueron positivas para CLIP-PCR. Entre ellos, 188, 14 y 2 estaban infectados con Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum y P. vivax/P. mezcla falciparum, respectivamente. La capacidad de realización de pruebas fue de 538 personas/día, con un costo de US$0,92/persona. La proporción de infección submicroscópica fue del 64,7%. Todos los individuos positivos recibieron tratamiento dentro de las 72 h posteriores a la extracción de sangre.

El uso de CLIP-PCR en MSAT en entornos de baja transmisión puede respaldar los esfuerzos de eliminación de la malaria en la región fronteriza entre China y Myanmar.

La detección y el tratamiento masivos (MSAT) de la malaria se definen como pruebas realizadas a toda una población en un área geográfica amplia y luego tratando solo a personas positivas, independientemente de si tienen síntomas de malaria. Este enfoque proporciona información importante sobre la epidemiología de la malaria, que puede ser útil para futuros esfuerzos de contención de la enfermedad [1], y es más probable que sea aceptado por la población objetivo que la administración masiva de medicamentos [2]. Además, el tratamiento profiláctico masivo con primaquina para controlar los brotes de Plasmodium vivax podría ser peligroso debido a una alta tasa de deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (hasta 14,8%) en la población del distrito objetivo [3]. Aunque recientemente la estrategia MSAT ha recibido renovada atención en el contexto de la eliminación de la malaria, la Organización Mundial de la Salud (OMS) no recomendó la MSAT como estrategia de intervención para interrumpir la transmisión de la malaria, ya que falta una herramienta de diagnóstico altamente sensible y de alto rendimiento. que sea rentable y fácil de operar [2, 4].

Para superar este desafío, se ha desarrollado un ensayo molecular de alto rendimiento en una plataforma de placa de 96 pocillos llamado Capture and ligation probe-PCR (CLIP-PCR) [5], que permite la detección directa del ARN de la malaria sin purificación de ácidos nucleicos ni transcripción inversa. con un límite de detección de 0,01 parásito de la malaria/μL de sangre o alrededor de 0,33 parásitos/μL si se utiliza una gota de sangre seca (DBS) de 3 mm [5, 8]. Esto cumple con el límite de detección objetivo recomendado por la OMS (2 parásitos/μL o menos) para la detección de malaria basada en PCR en entornos de baja transmisión [6], al tiempo que hace que la detección de malaria sea más fácil y menos costosa que la microscopía y la PCR anidada estándar [7, 8]. En este método, los objetivos de ARNr 18 S en muestras de sangre se liberan mediante lisis celular y se capturan mediante una serie de sondas con cola específicas en los pocillos de una placa de captura de 96 pocillos mediante hibridación tipo sándwich. Después de eliminar las sondas e impurezas adicionales, las sondas con colas unidas se ligan para formar plantillas monocatenarias para la posterior amplificación y detección de qPCR [5]. Recientemente, se desarrolló una versión mejorada de CLIP-PCR, la CLIP-PCR de múltiples secciones (mCLIP-PCR), que permite la identificación del género y especie de Plasmodium con un tiempo de ensayo mucho más corto [9].

La Región Especial II de Kachin (KSR2), una zona montañosa pobre ubicada en el norte de Myanmar, comparte una frontera terrestre de 214,6 km con el condado de Yingjiang de la provincia de Yunnan, China. Desde el conflicto regional en KSR2 en 2012, un gran número de desplazados internos inmigraron y se reasentaron a lo largo de la frontera entre China y Myanmar, lo que representa un riesgo para los logros de las actividades transfronterizas conjuntas de prevención y control de la malaria entre China (provincia de Yunnan) y Myanmar. [10,11,12,13,14]. En KSR2 de Myanmar, la incidencia de malaria aumentó del 2,1% en 2012 al 5,1% en 2016 [15]. Además, en 2016 se observó un brote de P. vivax en la ciudad de Laiza y sus alrededores [16], donde el número de casos de malaria aumentó drásticamente 2,3 veces, de 940 en 2015 a 2080 en 2016 [16]. El número de casos de malaria importados de Myanmar al condado de Yingjiang aumentó rápidamente de 35 en 2012 [17] a 185 en 2016 [16], poniendo en peligro el objetivo de eliminación de la malaria en el condado de Yingjiang para 2020 [18,19,20].

En este estudio, los autores evaluaron la viabilidad de utilizar CLIP-PCR en MSAT para determinar la prevalencia de la malaria en el distrito de Laiza en Myanmar. Comprender el nivel de prevalencia de la malaria en el distrito de Laiza puede proporcionar una base para controlar el brote de P. vivax y reducir la importación transfronteriza de malaria a Yunnan, China.

El estudio se realizó de abril a mayo de 2017. Se cubrieron todas las áreas del distrito de Laiza dentro de un radio de 2,5 km de la frontera con China, incluidas las regiones urbanas y suburbanas de la ciudad de Laiza, seis aldeas circundantes (Hpaw Gyung, Ja Htu Kawng, Mai Sak Pa, La Mai Yang, Mung Lai Hkyet y Mung Seng Yang), cinco aldeas distantes (Hpa Lap, Maga Yang, Na Ru, Pa Jau y Sha-It Yang), cuatro campamentos de desplazados internos (Dum Bung, Je Yang Hka, Hpum Lum Yang y Woi Chyai), una escuela y dos campamentos militares. La población total incluida fue de 23.169 personas que residían en bungalows de ladrillo y hormigón en la ciudad de Laiza, casas de tejas de madera en las aldeas y cobertizos temporales hechos de láminas de hierro y tejas de amianto en los campos de desplazados internos. Las áreas de estudio se representan en la Fig. 1.

Las áreas de estudio de MSAT para la malaria.

La prueba de diagnóstico rápido (RDT) de Plasmodium falciparum (Pf)/Pan-LDH fue un producto de Guangzhou Wondfo Biotechnology Co., Ltd., China (lote W05460602WC). Los kits CLIP-PCR 2.0 se adquirieron de Diacurate Technology Co., China ([email protected]), y el Peking Union Medical College, Beijing, donó kits CLIP-PCR de múltiples secciones (mCLIP-PCR) para la identificación del género y la especie Plasmodium. . Las secuencias de sonda relacionadas se proporcionan en el archivo adicional 1: Tabla S1. Un termómetro de frente infrarrojo sin contacto Omron (modelo MC-720) fue producto de Kunshan Reying Photoelectric Co., Ltd. (China), y se adquirió un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (qPCR) (modelo CG-5). Shanghai Likang Biomedical Technology Holding Co., Ltd. (China) y una incubadora con agitación (VorTemp 56) se obtuvieron de Labnet International (EE. UU.).

Se instaló un laboratorio de PCR en una habitación individual de 20 m2 en el primer piso del departamento de pacientes ambulatorios de la clínica de salud del municipio de Nabang (condado de Yingjiang, China). Se colocaron encimeras revestidas con baldosas cerámicas a lo largo de las tres paredes y en el centro de la habitación. Se instaló un gabinete de bioseguridad de flujo laminar vertical de un solo lado para dos personas cerca de la ventana frontal de la entrada, y se colocó un refrigerador estándar a la derecha del gabinete de bioseguridad. El diseño del laboratorio de PCR se muestra en la Fig. 2.

El diseño del laboratorio de PCR.

El muestreo fue realizado por siete trabajadores sanitarios capacitados, que notificaron a la comunidad objetivo un día antes del procedimiento. El día del muestreo (día 0), se llevó a cabo una breve reunión comunitaria para leer el formulario de consentimiento informado y entregar información sobre la malaria y los problemas de salud asociados. Los individuos fueron invitados a participar voluntariamente y firmaron un consentimiento informado. Después del registro del formulario de análisis de sangre, se midió la temperatura corporal de cada participante con un termómetro de frente infrarrojo sin contacto y se recogieron dos gotas de sangre con una tarjeta triple de recolección de muestras Whatman 903. Las manchas de sangre en la tarjeta triple abierta se secaron brevemente en una habitación ventilada colgando la tarjeta de una cuerda durante 30 a 120 minutos. Luego, las tarjetas se doblaron y se llevaron al laboratorio en una caja de almacenamiento especial el mismo día. Si un participante tenía una temperatura corporal ≥ 37,8 °C o presentaba antecedentes de fiebre en la última semana, se realizaba una prueba de diagnóstico rápido (PDR) en el momento de la extracción de la muestra de sangre y se preparaba un frotis de sangre en caso de un resultado positivo.

Cuatro técnicos del grupo de prueba colocaron las muestras de sangre recolectadas por el grupo de muestreo en la encimera del laboratorio para que se secaran durante la noche. Al día siguiente (día 1), se extrajeron dos discos que contenían sangre seca de 3 milímetros (mm) de diámetro de una gota de sangre de cada participante y se examinaron para detectar Plasmodium spp. utilizando CLIP-PCR con una estrategia de agrupación de matrices [5, 7]. Brevemente, las muestras se colocaron en una matriz de 10 × 10. Se reunió un disco de cada muestra en bruto y, por separado, se reunió un disco de cada muestra en una columna. Para evitar una posible contaminación cruzada, después de cada golpe, el cabezal del perforador de metal se sumergió en alcohol al 70% y se quemó sobre un mechero de alcohol durante 3 a 5 segundos, se dejó enfriar y se perforó tres veces en un papel de filtro en blanco, antes del siguiente uso en un mancha de sangre diferente. Los discos agrupados se colocaron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se incubaron con 170 µl (µL) de solución de lisis durante 30 minutos con agitación (1200 rpm) a 56 °C para lisar las células. Luego, se transfirieron 100 µL a cada pocillo de una placa de captura de 96 pocillos y se añadió 1 µL de mezcla de sondas para capturar 18 S rRNA del género Plasmodium. La solución se incubó con agitación (800 rpm) durante 120 min a 56 °C para capturar el objetivo en la placa. Después del lavado de la placa, las sondas de detección unidas al objetivo se ligaron a 37 °C durante 10 minutos para formar una plantilla para la posterior amplificación de qPCR en el mismo pocillo con química SYBR Green, utilizando cebadores específicos para las sondas del género. Para los pools sin procesar y los pools de columnas positivos, sus muestras de "intersección" fueron candidatas positivas y se confirmaron aún más analizando las muestras individuales sin combinarlas, utilizando CLIP-PCR para Plasmodium spp. o Plasmodium género y especie (ver más abajo), mientras que otros fueron declarados negativos.

Durante todo el cribado se utilizó lisado 3D7 de P. falciparum cultivado como control positivo del kit y se colocó aleatoriamente en la placa; Se utilizaron varios controles sin plantilla como controles negativos colocados en pocillos junto al control positivo. Como control interno para validar CLIP-PCR, los frotis de sangre de los participantes con RDT positivo del día 0 se confirmaron primero mediante microscopía de acuerdo con las recomendaciones de la OMS [21, 22], las manchas de sangre correspondientes se incluyeron, de manera aleatoria, en el grupo de muestras recolectadas el mismo día para pruebas CLIP-PCR posteriores por cuatro técnicos ciegos a la identidad de la muestra.

Los positivos de áreas donde se informó P. falciparum en los dos años anteriores se analizaron para determinar el género y la especie mediante CLIP-PCR de múltiples secciones (mCLIP-PCR) [9]. Brevemente, se colocó un disco de sangre seca de 3 mm de diámetro en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se incubó con 120 µl de solución de lisis para lisis. Luego se transfirieron 100 µL a un pocillo de una placa de captura de 96 pocillos y se añadió 1 µL de mezcla de sondas, que contenía tanto la mezcla de sondas de género como la mezcla de sondas de especies, para capturar Plasmodium específico de género, P. falciparum específico de especie y P. vivax secciones específicas de especie de 18 S rRNA en la placa. Después del lavado de la placa y una reacción de ligadura de sonda de 50 µL, la placa se calentó durante 1 min a 90 °C para liberar los productos ligados, y se transfirieron 5 µL a un nuevo pocillo de la placa de PCR para la identificación del género mediante qPCR realizada en un total Volumen de 25 µL/pocillo que contiene cebadores específicos para las sondas del género. Las muestras positivas al género se analizaron adicionalmente para la identificación de especies transfiriendo otros 5 µL a un nuevo pocillo para qPCR, ya sea con cebadores para las sondas específicas de la especie P. falciparum o con cebadores para las sondas específicas de la especie P. vivax.

El día 2, se proporcionaron resultados positivos de CLIP-PCR o mCLIP-PCR a un médico responsable del seguimiento de los participantes. Se realizó una PDR adicional en estos participantes positivos para confirmar algunos de los positivos y para ver cuántos de estos positivos estaban por debajo del límite de detección de la PDR. Independientemente de los resultados de la PDR, se inició el tratamiento para cada participante positivo de acuerdo con las recomendaciones de la OMS.

La base de datos se generó mediante Microsoft Excel 2010 y se analizó mediante estadística descriptiva (SPSS Statistics versión 20). La capacidad de prueba diaria se expresó como el número de participantes examinados mediante CLIP-PCR por día. El costo de detección por persona se determinó como el precio de compra real de los reactivos CLIP-PCR dividido por el número de participantes examinados. La tasa de prevalencia de parásitos (%) determinada por CLIP-PCR se calculó como el número de resultados positivos dividido por el número total de participantes examinados. En la confirmación por PDR de los resultados de la PCR, las muestras se consideraron microscópicas cuando los resultados de la PDR fueron positivos y submicroscópicas cuando los resultados de la PDR fueron negativos. El porcentaje de infecciones submicroscópicas se calculó en relación con el número de muestras positivas.

Se muestreó un total de 15.038 participantes del 26 de abril al 23 de mayo de 2017, con una tasa de cobertura poblacional del 64,91% (15.0381/23.169). Había 7260 hombres y 7778 mujeres; la edad promedio de los participantes fue de 24,34 ± 17,66 años (rango, 0,5 a 93 años). El día 0, las PDR examinaron a un total de 118 personas. Entre ellos, 75 tenían fiebre (temperatura corporal ≥ 37,8 ℃) en el lugar y 43 tenían antecedentes de fiebre en una semana, y 9 de los 118 dieron positivo en PDR. Entre ellos, 8 dieron positivo para P. vivax y 1 para P. falciparum mediante microscopía el día 1.

Se identificaron un total de 204 muestras positivas entre las 15.038 muestras de sangre utilizando kits CLIP-PCR para 35 placas. La tasa de prevalencia de parásitos basada en PCR fue del 1,36% (204/15.038), la capacidad de prueba fue de 537 muestras/día (15.038/28) y el costo de la detección fue de aproximadamente US$ 0,92 por persona ($13.835/15.038). Las 9 muestras positivas para PDR fueron confirmadas mediante CLIP-PCR. La sensibilidad y especificidad de CLIP-PCR en comparación con la microscopía fueron ambas del 100%.

La mayoría de las áreas encuestadas en este estudio informaron solo P. vivax en los dos años anteriores y, por lo tanto, las muestras positivas de CLIP-PCR confirmadas individualmente de estas áreas se consideraron infecciones por P. vivax sin pruebas adicionales. Las 53 muestras positivas de CLIP-PCR de áreas donde se informó P. falciparum en los dos años anteriores se analizaron para determinar el género y la especie mediante CLIP-PCR de múltiples secciones (mCLIP-PCR). Entre ellos, 53 fueron confirmados positivos a nivel de género mediante mCLIP-PCR con una tasa de acuerdo del 100% en comparación con CLIP-PCR. La identificación de especies con mCLIP-PCR fue 35 P. vivax, 14 P. falciparum, 2 P. vivax/P. falciparum mezcla y 2 negativos. Las 9 muestras positivas para RDT se identificaron a nivel de especie mediante mCLIP-PCR con los mismos resultados que la microscopía.

El día 2, a los 204 participantes positivos de CLIP-PCR se les realizó un seguimiento con confirmación RDT. De ellos, 132 de 204 fueron PDR negativos y se consideraron submicroscópicos o subpatentes, lo que dio lugar a una tasa de infección submicroscópica del 64,71% (132/204). Entre los 72 positivos a las PDR, 9 fueron confirmados positivos para P. falciparum o especies mixtas y 63 fueron P. vivax u otras especies distintas de P. falciparum positivo (Tabla 1). Los resultados de la identificación de especies con mCLIP-PCR y RDT se muestran en la Tabla 2.

Los 204 pacientes que dieron positivo con CLIP-PCR recibieron tratamiento, entre ellos, 188, 14 y 2 fueron tratados como P. vivax, P. falciparum y una mezcla de P. falciparum + P. vivax, respectivamente. La proporción de participantes infectados por P. vivax fue del 92,2% y la proporción entre infección por P. falciparum y P. vivax fue de 0,09. La distribución geográfica de la malaria se resume en la Tabla 3. El flujo de trabajo de detección de MSAT en este estudio se describe en la Fig. 3.

El diagrama de flujo de la proyección. (1) Las letras en negrita entre paréntesis fueron los resultados. (2) DBS: Manchas de sangre seca. (3) PDR: Prueba de Diagnóstico Rápido. (4) Pv P. vivax. (5) Pf P. falciparum.

Durante décadas desde la invención de la PCR, la mayoría de las innovaciones en diagnóstico molecular se centraron exclusivamente en la amplificación y la detección para mejorar la sensibilidad y la especificidad, pero pocas se centraron en el proceso preanalítico para reducir la complejidad de los ensayos moleculares, que es el verdadero impedimento para sus aplicaciones generalizadas. CLIP-PCR es conceptualmente similar a ELISA, siendo la sonda de captura y la sonda de detección análogas al anticuerpo de captura y al anticuerpo de detección. La amplificación por PCR posterior es una amplificación de señal (en lugar de una amplificación objetivo) análoga a la cascada enzimática para la detección de señales en ELISA. Además, el paso de ligación en CLIP-PCR ofrece dos beneficios importantes que ELISA no puede tener: (1) especificidad significativamente mejor y fondo reducido, ya que las sondas individuales no generarán señal; y (2) capacidad para evitar significativamente la contaminación, ya que sólo se detectan las sondas ligadas. La complejidad reducida de CLIP-PCR permite lograr un cribado molecular sensible y de alto rendimiento.

La contaminación, el alto costo asociado con procedimientos tediosos y el bajo rendimiento son algunos de los desafíos en la detección basada en PCR. Por lo tanto, la OMS exige que un laboratorio que realiza análisis de PCR con fines de diagnóstico se divida en al menos tres compartimentos físicamente separados para la preparación de reactivos, preparación de muestras y amplificación y detección de productos [22, 23]. En este estudio, CLIP-PCR se realizó con éxito en una habitación con solo un gabinete de bioseguridad, un refrigerador, una incubadora de escritorio con agitación (Shaker) y una máquina qPCR (Fig. 2), lo que sugiere que es factible realizar CLIP-PCR- diagnósticos basados ​​en la compartimentación del espacio del laboratorio, siempre que se observen las medidas estándar para prevenir la contaminación. Por ejemplo, se tomaron precauciones estándar para evitar la contaminación cruzada en la etapa de muestreo (por ejemplo, mediante el uso de tarjetas de muestreo triples y el flameado del cabezal del perforador después de cada perforado). En CLIP-PCR, la mayor parte del ARN objetivo se captura en el fondo del pozo, no en la solución, lo que lo hace menos propenso a la contaminación cruzada relacionada con aerosoles. Cualquier ARN diana no unido y con contaminación cruzada no puede ser una fuente de señal ya que, lo más importante, lo que se amplifica no es el ARN diana sino las sondas unidas ligadas, que permanecen unidas en la parte inferior. La plantilla de amplificación no se forma hasta que después del paso de ligación se ligan las sondas unidas justo antes de la amplificación. Estas características hacen que CLIP-PCR sea menos propenso a la contaminación cruzada y adecuado para su funcionamiento en un formato de placa de varios pocillos incluso en una sala que no sea una sala limpia dedicada a PCR. Este estudio también demostró que una configuración de laboratorio CLIP-PCR sin pasar por la extracción de ácido nucleico ayudaría a resolver los desafíos del diagnóstico oportuno por PCR y el tratamiento oportuno [2, 24, 25], con una solución para MSAT para la malaria: muestreo el día 0, detección por PCR el día 1 y el tratamiento el día 2. En este estudio, la capacidad de prueba CLIP-PCR fue de 538 personas/día y el costo de la detección fue de solo US $ 0,92 por persona. Aunque se ha informado que la detección CLIP-PCR se puede realizar agrupando hasta 36 muestras/pocillo [5] y que el costo por muestra disminuye aún más con el aumento en el número de muestras agrupadas [7], la estrategia de combinación de matrices para la detección de alto rendimiento se requiere concentración por parte del personal del laboratorio, y la posibilidad de un mal manejo de la muestra aumenta con el número de muestras reunidas. Por lo tanto, este estudio se decidió por una estrategia de agrupación de matrices de 10 × 10, con un mecanismo de doble verificación intrínseco al enfoque de agrupación de matrices para minimizar el posible error (es decir, cada muestra positiva también debe tener su agrupación sin procesar y su agrupación de columnas positivas. Si no, algo anda mal). La capacidad de detección se limitó a <600 personas/día por máquina qPCR, según la velocidad de recolección de muestras y la capacidad de procesamiento del agitador y la máquina PCR.

En comparación con la PCR “ordinaria” con combinación [26, 27], que es otro medio eficiente y válido para la detección de malaria a gran escala, CLIP-PCR con combinación tiene las siguientes ventajas importantes: (1) No implica extracción de ácido nucleico, por lo tanto es más susceptible al procesamiento de alto rendimiento y está mucho menos preocupado por la contaminación de la muestra o la degradación del ácido nucleico durante o después de la extracción; También es mucho menos costoso que utilizar dispositivos automatizados de extracción de ADN/ARN. (2) El ensayo CLIP-PCR puede analizar muestras agrupadas de DBS sin perder sensibilidad [5], ya que todos los ARN de fondo de las muestras negativas se eliminan sin interferir en la amplificación posterior. Por el contrario, en la PCR estándar con combinación, la eficiencia de extracción o amplificación puede verse afectada negativamente en las muestras combinadas cuando se añaden ácidos nucleicos de fondo que interfieren en las muestras negativas. (3) CLIP-PCR es menos propenso a la contaminación cruzada que la PCR ordinaria. Sin embargo, CLIP-PCR requiere una máquina qPCR, lo que puede resultar demasiado costoso para los laboratorios de países con recursos limitados. Una estrategia similar utilizando LAMP [28] puede reducir el costo general de instalación.

Zhao et al. han evaluado el rendimiento de CLIP-PCR, PCR anidada y PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). en la prueba de 1.005 muestras individuales recolectadas en la ciudad de Laiza y sus alrededores en 2015 [29]. El autor afirmó que la sensibilidad de CLIP-PCR es significativamente menor que la de otros métodos moleculares [29], en contraste con comparaciones de campo similares en la misma área informada [7,8,9]. Un defecto importante en Zhao et al. [29] como estudio de comparación fue que CLIP-PCR se evaluó utilizando solo muestras de sangre seca (DBS) con calidad desconocida, mientras que la PCR anidada y qRT-PCR se evaluaron solo con muestra de sangre fresca [29]. No se intentó evaluar la PCR anidada, qRT-PCR utilizando las mismas muestras de DBS, mientras que cuando se evaluó CLIP-PCR utilizando muestras de sangre estándar, Zhao et al observaron la misma alta sensibilidad de 0,01 parásitos/μL que los otros métodos moleculares. . [29]. Por tanto, la conclusión de Zhao et al. [29] sigue siendo cuestionable. En una evaluación reciente de 4580 muestras de DBS asintomáticas, una comparación lado a lado del ensayo de género CLIP-PCR con qPCR estándar en un subconjunto de 100 muestras de DBS asintomáticas mostró una concordancia del 100 % entre los dos métodos, con una alta correlación (R2 = 0,81 ) entre los valores de Cq de los dos métodos [9].

Como tanto CLIP-PCR como mCLIP-PCR se validaron originalmente con qPCR estándar utilizando gotas de sangre seca [5, 9], y como la mayoría de las configuraciones de PCR estándar requieren condiciones de laboratorio de alto nivel y no son adecuadas para la detección de alto rendimiento [24], Este estudio ya no verificó los resultados de CLIP-PCR utilizando otros protocolos de PCR en el laboratorio de campo. En su lugar, se utilizó control de calidad con controles sin plantilla, controles positivos del kit (lisados ​​3D7 de P. falciparum cultivados), así como 9 muestras positivas para PDR identificadas el día 0 en la misma población. Los resultados positivos de las PDR incluyeron 8 P. vivax positivos confirmados y 1 P. falciparum positivo confirmado mediante microscopía el día 1. La detección ciega con CLIP-PCR indicó una positividad del 100 %, y mCLIP-PCR identificó las especies esperadas.

Como se muestra en la Tabla 3, según los resultados de la PCR, la prevalencia de malaria fue la más alta en la aldea de Sha-it Yang (19,10%), lo que puede atribuirse a su ubicación. La aldea Sha-it Yang está lejos de la ciudad de Laiza (Fig. 1), en un valle remoto cerca del bosque, donde se instaló un campamento militar étnico, lo que indica un alto riesgo de transmisión de malaria en condiciones donde el servicio médico no era fácilmente accesible [ 30]. Los hallazgos del estudio también mostraron que la malaria se detectó principalmente en la ciudad de Laiza y áreas cercanas, con la mayor prevalencia en la ciudad, mientras que no se detectaron casos en áreas distantes. Una razón para tal distribución de casos podría ser que la ciudad de Laiza está situada en una zona cálida, de baja altitud y densamente poblada, donde la transmisión de malaria es perenne con un pico estacional, mientras que en las zonas distantes de gran altitud (a excepción de Sha-it Yang Village), la transmisión se interrumpe en la estación fría [16]. Otra razón es que este estudio comenzó a finales de abril de 2017, la etapa inicial del pico de la epidemia de malaria en la ciudad de Laiza, que experimentó el brote de P. vivax en 2016 [16]; por lo tanto, podría haber una gran cantidad de portadores asintomáticos y de personas recientemente infectadas en la ciudad de Laiza durante el período del estudio. Este estudio mostró que la tasa total de prevalencia de parásitos basada en PCR en la población analizada fue del 1,36% y que P. falciparum/P. vivax fue de 0,09, lo que indica un área de transmisión muy baja según la categorización de la OMS [31]. La proporción de infección subpatente fue del 64,7%, similar a la tasa del 67% de infección submicroscópica por P. vivax informada por Moreira et al. [32] y Cheng et al. [33], lo que indica un reservorio de parásitos potencialmente infeccioso muy grande en el área de estudio.

Este estudio tiene algunas limitaciones. Sólo el 64,9% de la población objetivo estuvo cubierta por el cribado. Aunque el equipo de recolección de muestras informó a la comunidad objetivo con un día de anticipación, algunos residentes no quisieron ofrecerse como voluntarios, mientras que otros no pudieron llegar a tiempo, especialmente aquellos que trabajan a menudo en el bosque y, por lo tanto, corren un alto riesgo. Esto puede haber causado un sesgo de muestreo. Estos resultados indican que MSAT necesita un apoyo logístico eficiente. Además, el laboratorio de PCR se estableció en el lado chino de la frontera debido a preocupaciones de seguridad, alojamiento de los investigadores y, en general, mejores condiciones que en el área de estudio de Myanmar. Aunque el laboratorio estaba a sólo 200 m de algunos de los sitios de recolección, no estaba ubicado en el campo propiamente dicho. Por último, la tasa de infección submicroscópica se calculó basándose en los resultados de la PDR, no en el análisis microscópico; el número real puede ser menor.

Una estrategia para incluir CLIP-PCR en MSAT para entornos de baja transmisión tiene las ventajas de una mejor sensibilidad diagnóstica, alto rendimiento, rentabilidad general y puntualidad del diagnóstico y tratamiento. Todos estos factores pueden ser mejoras potenciales en la realización de MSAT en áreas de baja transmisión para apoyar los esfuerzos de eliminación de la malaria en la región GMS.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Sonda de captura y ligadura PCR

Región especial II de Kachin

PCR con sonda de ligadura y captura multisección

Detección y tratamiento masivos

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real

Prueba de diagnóstico rápido

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Agradecemos sinceramente a Health Poverty Action y al Departamento de Salud de la Región Especial II de Kachin por proporcionar recursos humanos. Su participación es la piedra angular del éxito de este estudio. Agradecemos al Centro de Salud del municipio de Nabang por proporcionarnos espacio de laboratorio, logística y recursos humanos.

El diseño, la implementación, el análisis, la interpretación de los datos y la redacción del manuscrito del estudio fueron apoyados por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81960374), la tecnología y los kits de mCLIP-PCR en el estudio fueron apoyados por la Fundación Nacional de Ciencia y Tecnología. Proyectos (2018ZX10101001) y por el Centro de Introducción de Experiencia en el Extranjero para la Innovación Disciplinaria (“Centro 111”) (BP 0820029) a ZZ

Xiao-dong Sun, Ya-ling Zhao y Zu-rui Lin han contribuido igualmente a este trabajo.

Instituto de Enfermedades Parasitarias de Yunnan, Centro Provincial de Innovación Colaborativa para la Salud Pública y la Prevención y el Control de Enfermedades de Yunnan, Laboratorio Provincial Clave de Investigación y Control de Enfermedades Transmitidas por Vectores de Yunnan, Centro Provincial de Investigación de la Malaria de Yunnan, Puer, 665000, China

Xiao-dong Sun, Zu-rui Lin, Yao-wu Zhou, Peng Tian, ​​​​Kai-xia Duan, Chun-li Ding y Qi-yan Chen

Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas; Escuela de Medicina Básica, Peking Union Medical College, Beijing, 100005, China

Ya-ling Zhao, Ye Zhao y Zhi Zheng

Centro de Yingjiang para el Control y la Prevención de Enfermedades, Yingjiang, 679300, China

Shi-gang Li y Xiang-rui Guo

Brown School, Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

Yuan Sui y Duo-quan Wang

Centro Colaborador de la OMS para Enfermedades Tropicales, Centro Nacional de Investigación Internacional sobre Enfermedades Tropicales, Laboratorio Clave de Biología de Parásitos y Vectores, Ministerio de Ciencia y Tecnología, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Enfermedades Parasitarias, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades, Centro Chino para la Investigación de Enfermedades Tropicales, Shanghai, 200025, China

Shen Ning Lu

Iniciativa para la Eliminación de la Malaria, Instituto de Ciencias de la Salud Global, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Chris Cotter

Departamento de Salud de la Mujer y el Niño, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Chris Cotter

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XD S y ZZ concibieron y diseñaron este proyecto. XD S y ZR L organizaron y supervisaron la implementación de campo, XD S, YL Z, YZ, CL D, ZR L, SG L, XR G, PT, KX D, SN L, YS y QY C realizaron el trabajo de campo, recopilaron y datos interpretados. XD S y ZZ escribieron el borrador del manuscrito y XD S preparó las Figs. 1 y 2 y ZZ, DQ W, CC e YS revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Duo-quan Wang o Zhi Zheng.

El Instituto Yunnan de Enfermedades Parasitarias (YIPD, China) y el Departamento de Salud de KS2 de Myanmar aprobaron el protocolo del estudio. El Comité de Ética de YIPD aprobó el estudio [Número de referencia: YIPD-EC-2017(4)]. Todos los participantes fueron informados en su lengua materna mediante una breve reunión. Los individuos participaron voluntariamente y firmaron legalmente el consentimiento informado antes de la extracción de sangre. Para niños menores de 12 años, se firmó el consentimiento de los padres o tutores antes de la extracción de sangre. No hubo información de identificación personal de ningún participante en este artículo.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Secuencias de sonda.

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Reimpresiones y permisos

Sun, Xd., Zhao, Yl., Lin, Zr. et al. Implementación de un nuevo método de PCR con sonda de captura y ligadura en detección y tratamiento masivos para apoyar los esfuerzos de eliminación de la malaria en la región fronteriza entre China y Myanmar. Malar J 22, 21 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04449-x

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Recibido: 30 de junio de 2022

Aceptado: 07 de enero de 2023

Publicado: 19 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04449-x

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